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猪精液常温保存研究进展

来源:http://www.yihekongjian.com 作者:老时时彩 时间:2019-11-24 14:25

2005年6月28日,由宁波市畜牧工程技术研究服务中心承担的《猪精液常温长时间保存技术研究》科研攻关项目,通过了宁波市科技局组织的专家鉴定。 本项目由2004年列入宁波市科技计划,在一年半的项目实施期里,实施小组全体科技人员认真负责、艰苦努力,对种公猪营养调控、猪精液常温保存长效稀释液配方、猪精液常温保存温度维持方案以及便携式非电源精液恒温运输保存箱等技术进行了深入研究,使猪精液常温保存时间达到了120小时。项目的实施为猪人工授精技术的产业化提供了技术保障,同时,使本市的猪品种改良工作上了一个新的台阶。 鉴定委员会在认真听取项目实施小组的工作汇报、详细审阅项目鉴定材料的基础上,经过充分评议,一致认为:本项目紧扣良种扩繁的技术主题,工作扎实有效。①建设了目前国内规格最高、设施最先进的猪人工授精中心,为省内首家;②制订并颁布了《猪人工授精技术操作规范》地方标准;③研究成功猪精液常温保存长效稀释液配方,使猪精液常温保存时间达到120小时,为国内领先;④研制的精液恒温保存箱和运输箱能维持温度恒定达15小时以上;⑤精液保存和运输过程中温度维持方案实用有效,为国内首创。

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一、影响精液保存效果的外界因素 随着人工授精技术的日益发展与提高,人们对影响精液保存效果的诸多因素进行了广泛而深入的研究。

采下的精液,首先要进行过滤,除去精液中不可用的蛋白质凝块等物质,再进行颜色、气味、精子活力、密度、射精量、顶体完整率、畸形率及抗温测定,各项指标都达到要求,鲜精活力要在0.6以上。

4 渗透压与精子膜结构 渗透压对精子的影响与pH有相等的重要性,二者的相互关系尤为密切,渗透压过高过低都不利于精液储存。黄建国等通过添加葡萄糖的用量来调节渗透压,对用不同渗透压的稀释液稀释猪精液后的保存时间进行了比较,表明猪精液稀释液的渗透压指标,即冰点下降度在与猪精液的冰点下降度接近时,保存效果较好。在一定范围幅度内的冰点下降度(0.42~0.72),保存效果组间差异不显著。刘丑生等在猪精液常温条件下延长保存时间的研究中也得到类似的结果,在一定范围内的渗透压(5%~7%的葡萄糖溶液)对猪精子有效存活时间、总存活时间影响不大。

-30℃的稀释液备用。二是稀释液应沿杯壁缓慢倒入精液中,慢慢摇匀。三是稀释后的精液要求每毫升含精子数1-3亿个。

2 PH值及其缓冲体系 当精液的pH值降低时,精子的代谢和活动力都减弱。在附睾内,精子的生存环境为弱酸性,精子呈休眠状态。因此可利用酸性环境抑制精子的活动。为使精液能在室温环境保存多日,精液可用二氧化碳饱和,或使pH降到6.35,这相当于使精子处于附睾内状态,也和低温抑制其活动相似。但从各类稀释液的pH值来看,如BTS、Kiev、BL-1的pH值为7.2,Reading、 Zorpa液的pH值为6.4等,不同的稀释液贮存的最佳pH有所不同。陈大芳,刘丑生等研究得出稀释液pH在6.5左右保存效果较好,郭洪杞等也得出稀释液pH在6.0~6.5之间,稀释后精液pH在6.5~7.0之间,对延长精子寿命具有显著效果。研究pH对精子的影响须有适当的缓冲剂,以维持pH的恒定。磷酸盐类和柠檬酸钠是多年来常用的,近年来采用的三羟甲基氨基甲烷碱性缓冲液,对代谢酸中毒和酶活动反应具有良好的缓冲作用。此外,在BW25和Androhep配方中,还尝试使用了MOPS、HEPES,这是一类两性离子缓冲剂。Crabo等和Ferguson等得出这类两性离子缓冲剂在维持精子活力方面优于传统的缓冲液,但MOPS和HEPES之间不存在显著差异。通过葡萄糖含量调节渗透压接近300mOsm,他们还对MOPS和HEPES的最佳使用量进行了对比试验。

5、输精

为了有效地开展猪人工授精,精液的稀释保存是关键技术。精液冷冻技术的成功,使精液得以长期保存,但由于猪的冷冻精液受胎率仍然偏低,加之冷冻技术难度大,冷冻设备投资高,还不能在生产中广泛应用。而公猪精液的低温保存不如常温保存效果好,因此,公猪精液常温保存在生产上具有很大的实用价值。国际上对猪精液液态保存十分重视,多年来,各国研究者也做了大量的研究工作。

3、精液的稀释

1 温度的影响 在影响精子存活的外界环境因素中,保存温度至关重要。猪精子对低温很敏感,只能耐受15℃以上温度,这涉及到膜对温度的敏感性。Buhr从细胞分子水平进行了探讨,认为猪精子头部原生质膜的流质状态在一定条件下将会产生变化,这种变化反应了正常的分子重排受到了钙离子和温度的影响。大量有关温度影响的试验不断进行,霍秀香等在猪精液保存方法试验中发现,梅山猪、约克夏猪精液保存15℃极明显好于10℃、20℃、25℃。董载勇等的配方筛选试验也显示了在16~18℃恒温保存时,精子的总存活时间和生存指数都较13~24℃、15~20℃条件下好。VernoPursel研究表明,虽然酪蛋白以及卵黄中含低密度脂蛋白的部分已知能降低冷休克和冷却对精子的损害作用,但如果贮存温度在15℃以上,受精力能更好地保存,因此猪精液保存普遍都在15~18℃ 温度下进行。

精液稀释应注意以下几点:一是稀释液的温度与新采下的精液的温度一致,因此,每次采精前应准备好20

为了更进一步的研究精子在体外保存中的变化,人们在有关精子结构的方面也作了大量的研究工作。Woelders研究指出,精子细胞维持膜的渗透性是精子存活的一个基本条件。同其他种类的细胞相比,精子细胞膜在受到损害后自我修复的能力较低。精细胞膜具备较好的渗透性能保证精子维持必须的膜内外离子强度和渗透压。细胞膜在储存过程中的变化引起了人们的关注。其中脂类过氧化反应与膜结构的改变密切相关。精子细胞膜磷脂中含量相对较多的不饱和脂肪酸在有氧条件下极易产生脂类的过氧化反应,从而破坏膜的脂质状态。精液长时间贮存而引起脂类过氧化反应将对精细胞膜造成伤害。因此,提供一个能防止形成脂类过氧化物的环境,可能是稀释液对维持精子在体外保存期中活力方面所起的关键因素之一。在保存精液时,保持厌氧环境,有利于防止精液中过氧化物的形成。在大多数精液稀释液中都包含有助于将脂类过氧化作用降低到最低限度的成分。

2、精液品质检查

3 抗菌素的研究在稀释液中加入抗菌素是精液保存成败的关键。常用的抗菌物质有青霉素、链霉素、氨苯磺胺等。Revell使用不同的抗生素稀释保存精液作对比试验,分别采用林肯霉素和壮观霉素,泰乐菌素,青霉素和链霉素,多粘菌素B,还有一组不加任何抗生素。将保存3 d后的精子进行活力比较,保存效果呈现了较大的差异。不加抗生素的精液其精子活力很快下降,而LS和泰乐菌素保存效果较好,显著优于PS;多粘菌素前期保存效果优于泰乐菌素,但6d以后活力显著下降。他们还认为,卡那霉素和新霉素的作用效果与LS相似,庆大霉素与PS作用效果一致。为了选择最适合精液保存的抗生素,他们又对LS和 PS的作用效果进行了比较,结果发现3 d以后二者出现了较大的差异,LS优于PS。王祖昆等测定得出在10~20℃温度下,加有庆大霉素的稀释液保存60d内无菌。但不同的抗生素其稳定性和对精子的毒害作用有所差别。有人提出,抗生素的选用应依据特定pH条件下其稳定性以及它们与稀释液中其它成分的相容性来决定。Brander和Pugh验证了青霉素在柠檬酸盐缓冲液中具有最好的稳定性。Tris-citrate缓冲液更能加强青霉素和链霉素的作用。

保存用的精液原精液精子密度每毫升不少于1.5亿,精子活力不低于0.8,否则不宜保存。精液运输过程中应防止剧烈的振荡和温度变化过大。如果低温保存精液运输,运输箱内应装满冰块,常温保存精液的运输,也应该维持较低和固定的温度,最好用恒温运输箱运输。

二、延长精液贮存时间的添加物BSA是一种从牛血清中提取的、含有580多个氨基酸组成的单肽链。1971年,Bredderman和Foote得出BSA能增强牛精子的生存能力,认为BSA能够替代或保持精于细胞的脂蛋白外膜。BSA对于多种低分子量物质具有吸附性,因此它能够去除精细胞中的代谢产物,从而使膜的渗透性得以改变,在这方面,BSA比其它一些高分子物质如PVP,α—乳清蛋白,β—乳球蛋白等更有效,且它的作用不受稀释液离子强度(Ca2+、HC03-、PO43-)的影响。为了验证BSA的作用效果,Hannover team使用BSA、PSA和Ovalbumin作对比试验,将精液在15℃保存144h后,观察其精子活力和顶体完整性。结果对所有含有BSA的稀释剂在精子活力的保存方面都起了积极的作用,而对顶体无较大影响。1989年,Revell和Glossop研制的Reading液,用聚乙烯醇替换了BSA,将精液的保存期延长至6d,在对顶体的保护方面也得到了进步。而Hannorer认为聚乙烯醇的确切使用效果缺乏事实依据。但不管怎样,人们对于BSA等的研究促进了猪精液保存效果的改善,使猪精液的常温保存时间延长成为可能,这就促使人们继续寻找和探索有利于长期贮存精液的物质及其作用机制。经稀释液稀释保存的精液,在精子存活时间尽可能长的情况下,与受精力相关的精液品质,如精子活力,具备完整顶体的精子个数等,将会对人工授精的效果产生较大的影响。多年来,各国研究者也在如何维持精子活力,保护精子顶体方面作了大量的研究工作。

核心提示:要提高猪人工授精的受胎率,须做好以下几个环节:

四、结语 到目前为止,将猪精液常温保存3 d以上而保持良好受精率的稀释液配方尚未取得令人满意的结果,但却有所进步。由于不同个体公猪的精液在液态保存期间保持受精力的差异极大,再加上季节、环境等诸多因素的影响,就使得我们难于在实际生产条件下获得有关精液贮存期间在受精力方面的统一可靠的数据。并且,对于经过保存的精液受精力高低的评价是将输精剂量和输精次数排除在外的。考虑到影响精液质量的诸多因素,在现有使用效果较好的稀释液配方的基础之上,我们可以通过对pH、温度、渗透压的控制来寻找适合本地生产条件的稀释液配方,这就涉及到对稀释液成分的选择和量的选择。对出现的一些使用效果较好的特殊添加物,可以通过对比试验验证其在精液保存中能否起到积极作用。

4、精液的保存和运输

三、配方的实践在理论研究的基础之上,人们对稀释液的配方作了大量的对比筛选试验。Moretti将Zofiesco液加以改进,提高其中葡萄糖添加比例,不用BSA,取名Modena液。Summermatter根据自己的试验结果,表明Modena液的使用效果并非像意大利国内报道所述。通过添加Cys,BSA和进一步增加葡萄糖含量,Summermatter研制成一种新的稀释液,取名Butchwile液,用该稀释液保存3d的精液受胎率达到78.5%。后来又出现了MR-A液,据报道用该液保存7-8d的精液输精,母猪产仔率和窝产仔数仍达到76.2%和8.5头,但其成分不详。Kiev液成分简单,可保存1~3d,授精后母猪产仔率为80.5%,窝产仔8.2头。Zorlesco液可常温保存7~8d,输精后受胎率可达66.7%,窝产仔平均为8.2头,而8-9d输精受胎率为51.2%,窝产仔平均7.8头。后来又出现了应用效果较好的Androhep液、Reading液等。国内有的还筛选出了含磷安液、果糖、蜂蜜、丁维葡萄糖等的稀释液配方。然而关于各类稀释液配方的应用效果报道不一,有的也缺乏稳定性和实用性。

猪的人工授精,是现代化养猪的一项技术措施,是一种先进的配种方法,采用这种先进技术,不仅能充分利用优良种公猪,加速猪群改良,而且还能大大减少种公猪的饲养数量,降低养猪生产成本,有效地控制由于公母猪直接交配而带来的传染病。要提高猪人工授精的受胎率,须做好以下几个环节:

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1、采精

采精应注意的事项:一是采精前,必须先训练公猪爬跨采精架,使其对假母猪建立稳固性条件反射;二是凡有可能与精液接触的器具都必须先洗涤干净并进行充分消毒。三是采精后,采得的精液应迅速送往精液检查室,在20-30℃的温度下对精液品质进行检查。

输精是人工授精的最后一个技术环节,也是母猪能否获得较高受胎率的重要环节,因此必须注意以下几点:一是严格消毒所有输精器械;二是所输精液的活力在0.5级以上;三是用0.1%的高锰酸钾溶液清洗母猪外阴,以免因输精而引起母猪生殖道疾病;四是在母猪开始发情高潮后24小时输精,有效精子数保证在10-20亿个,间隔8-12小时后,再输一次;五是输精时不要强行压入,要沿上壁缓慢推进子宫内,以免进入膀胱。

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